近10年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域,为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为,人类基因组并非人们想象的那样稳定,诸如基因重排、扩增、缺失,突变和DNA甲基化类型改变等时有发生,这些改变对于基因表达和调控,以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。

核心提示:近10年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域,为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认近10年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域,为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为,人类基因组并非人们想像的那样稳定,诸如基因重排、扩增、缺失,突变和DNA甲基化类型改变等时有发生,这些改变对于基因表达和调控,以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。

医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法,是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术,本节
不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau
等成功地从蜡块中提取出高质量的DNA,完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要,结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史,而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究,对肿瘤发生的分子机制的探讨,诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节
重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。

医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法,是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术,本节
不再赘述。Goelz和Dubeau
等成功地从蜡块中提取出高质量的DNA,完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要,结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史,而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究,对肿瘤发生的分子机制的探讨,诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节
重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。

一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法

一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法

从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤,是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术,是用机械的方法破碎组织,切除多余的石蜡,直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K的提取缓冲液加温孵育,然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整,但可被限制性内切酶切割,因而适于点杂交,印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡,保证了组织的完全破碎,使细胞与消化液充分接触,使DNA释放和蛋白去除更加完全;其次通过两步消化的方法,将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除,仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子,从而提高了DNA质量,适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等对上述两种方法进行了比较,发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致,非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。

从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤,是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术,是用机械的方法破碎组织,切除多余的石蜡,直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K的提取缓冲液加温孵育,然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整,但可被限制性内切酶切割,因而适于点杂交,印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡,保证了组织的完全破碎,使细胞与消化液充分接触,使DNA释放和蛋白去除更加完全;其次通过两步消化的方法,将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除,仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子,从而提高了DNA质量,适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等对上述两种方法进行了比较,发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致,非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。

表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤

表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤

1.切除多余石蜡,暴露组织2.将组织切碎,称重;3.溶于TE9提取液,高速混悬2~3min;于48℃放置24h,其制备见表18-6;4.再次混悬组织,加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%,孵育40h;5.用等体积酚-氯仿溶液抽提3次;6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA7.-70℃放置2~4h8.9000×g离心1h9.沉淀物用70%乙醇洗1次10.干燥,TE溶解。

1.切除多余石蜡,暴露组织
2.将组织切碎(最大径<0.5mm),称重;
3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml,50~500mg/10ml),高速混悬2~3min;于48℃放置24h,其制备见表18-6;
4.再次混悬组织,加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%,孵育40h;
5.用等体积酚-氯仿溶液抽提3次;
6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA
7.-70℃放置2~4h
8.9000×g离心1h
9.沉淀物用70%乙醇洗1次
10.干燥,TE溶解。

表18-6 TE9 DNA提取液的制备

表18-6 TE9 DNA提取液的制备

500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmoo/LNaCl1%SDS500μg/ml蛋白酶K PH8.0

500mmol/L Tris
20mmol/L EDTA
10mmoo/L NaCl
1% SDS
500μg/ml 蛋白酶K
PH8.0

5μm组织切片

5μm组织切片

常规脱蜡、水化

常规脱蜡、水化

第一次溶液A孵育

第一次溶液A孵育

第二次溶液A孵育

第二次溶液A孵育

氯仿-异戊醇抽提

氯仿-异戊醇抽提

美高梅app网页,↓

RNA酶和蛋白酶消化

RNA酶和蛋白酶消化

酚抽提

酚抽提

沉淀

沉淀

(却除未螺旋化DNA)↓

透析

透析

图18-6 石蜡包埋组织DNA提取流程

图18-6 石蜡包埋组织DNA提取流程(Drbeau等,1986)

溶液A

溶液A

2×SSC100μg 蛋白酶K/ml1% SDS

2×SSC
100μg 蛋白酶K/ml
1% SDS

不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂交分析需要10~15μg大片段DNA,因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高,小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反,多聚酶链反应则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行,分析所需的DNA很少,0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多,除上述两种方法外,还有更简便的直接水煮法、蛋白酶消化法。这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤,直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h,DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板,进行PCR扩增,但是,我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA,扩增率较低,且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合,亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq
DNA多聚酶的抑制所致。

不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂交分析需要10~15μg大片段DNA,因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高,小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反,多聚酶链反应则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行,分析所需的DNA很少,0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多,除上述两种方法外,还有更简便的直接水煮法(Sle-bos,et
al, 1990;Smit, et al. 1988)、蛋白酶消化法(Impraim et al. 1987;Brice,
et al.
1989)。这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤,直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h,DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板,进行PCR扩增,但是,我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA,扩增率较低,且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合,亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq
DNA多聚酶的抑制所致。

二、影响DNA提取质量的因素

二、影响DNA提取质量的因素

1.固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本,DNA保存完好,可以获得高分子量DNA。Warford等对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察,发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段:①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化;②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白酶K消化,酚/氯仿抽提和纯化等步骤,可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。

1.固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本,DNA保存完好,可以获得高分子量DNA。Warford等对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察,发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段:①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化;②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白酶K消化,酚/氯仿抽提和纯化等步骤,可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。

bramwell等发现,甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低,醋酸甲醇可导致DNA明显降解。Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高,但产量明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸和含氯化汞的固定液处理标本不能获得完整的DNA。

bramwell等发现,甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低,醋酸甲醇可导致DNA明显降解。Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高,但产量明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸和含氯化汞的固定液(Zenker,Bs)处理标本不能获得完整的DNA。

乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等用无水乙醇固定标本48h,最长达2年,均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本。经限制性内切酶消化后,乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性卫星带,说明DNA被完成消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。

乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等用无水乙醇固定标本48h,最长达2年,均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本(19.4μg/mm3)。经限制性内切酶消化后,乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性卫星带,说明DNA被完成消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。

Sato
等用AMex方法处理组织,既可保存许多抗原成分,亦可使大分子量DNA完好无损。其基本方法为:将组织放至4℃丙酮浸透,移至-20℃过夜。然而再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min,苯甲酸透明两次,每次15min,最后60℃真空浸蜡2~3h,石蜡包埋。结果显示,每10mg
AMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±14.53μg,与新鲜组织产量相当。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术,可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变,是一种理想的DNA保存方法,特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。

Sato
等用AMex方法处理组织,既可保存许多抗原成分,亦可使大分子量DNA完好无损。其基本方法为:将组织放至4℃丙酮浸透,移至-20℃过夜。然而再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min,苯甲酸透明两次,每次15min,最后60℃真空浸蜡2~3h,石蜡包埋。结果显示,每10mg
AMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±14.53μg,与新鲜组织产量相当(70.4±13.76μg)。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术,可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变,是一种理想的DNA保存方法,特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。

2.固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解,虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应,但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此,那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而,Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示,随着固定时间的延长,可螺旋化的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后,DNA产量减少到30%,由此可见,不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。根据Dubeau等经验,常规组织固定应在12h以上至110之内。

2.固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解,虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应,但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此,那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而,Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示,随着固定时间的延长,可螺旋化(Spoolable)的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后,DNA产量减少到30%,由此可见,不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。根据Dubeau等经验,常规组织固定应在12h以上至110之内。

3.固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节
,其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸;加热到65℃时,氢键开始断裂;约90℃时,产生两条单链分子。在此变性状态下,甲醛与酸反应很快,通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。

3.固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节
,其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸;加热到65℃时,氢键开始断裂;约90℃时,产生两条单链分子。在此变性状态下,甲醛与酸反应很快,通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。

最近,Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解,是由于固定温度高,pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定,可以明显改善DNA保存。

最近,Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解,是由于固定温度高,pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定,可以明显改善DNA保存。

酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为,强酸可导致DNA的完全解聚,而弱酸也能引起一些结构的改变。当pH达到2.5以下时,几乎所有的碱基之间氢键解离,使DNA双链断裂而产生不可逆的变性;随后出现N-糖苷键水解,使嘌呤残基游离;最后,多聚核苷之磷酯键缓慢水解,仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键,因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而,即使福尔马林被氢氧化钠中和,在室温下DNA亦发生降解,提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。

酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为,强酸可导致DNA的完全解聚,而弱酸也能引起一些结构的改变。当pH达到2.5以下时,几乎所有的碱基之间氢键解离,使DNA双链断裂而产生不可逆的变性;随后出现N-糖苷键水解,使嘌呤残基游离;最后,多聚核苷之磷酯键缓慢水解,仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键,因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而,即使福尔马林被氢氧化钠中和,在室温下DNA亦发生降解,提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。

网站地图xml地图