人胃螺旋菌(Gastrospirillumhominis,GH)是近来人们认识到的除幽门螺杆菌外的另一类与人胃炎有关的微生物,国内报道人群感染率明显高于国外。由于目前国内外对GH尚未分离培养成功,对Gh的研究仅限于组织学及形态学观察,影响了对Gh本身及其致病性方面的深入认识。我们自一接受胃镜检查的病人中,观察到有Gh和Hp混合感染存在,并最终纯化分离到了Gh和Hp。在对Gh的传代培养中,我们较系统地观察了不同培养条件及冷冻保存对其形态等的影响。现简要报告如下。

幽门螺杆菌与胃炎和胃溃疡的发生有关联。众所周知,胃炎与溃疡属于多发病、常见病,其病因不明。自从Warren和Marshall于1983年首先从胃炎患者的胃粘膜上皮组织中观察螺杆菌和分离到Hp,他们认为胃炎或溃疡病的发生与Hp的感染有密切的关系。近年来国外在这方面进行了不少研究工作;国内亦发现本菌在慢性胃炎及消化性溃疡的病人中检出率较高。但有关Hp的生物学特性及致病性的研究则很少。现将我们对这方面的研究结果报告如下。

1 材料和方法

1 材料和方法

1.1 标本来源

1.1 材料
各型胃病患者共200例。年龄19岁~80岁,平均46.9岁。男222例,女78例。患者经胃镜检查时,均在胃窦部或求部钳取粘膜组织两块,置于含10%灭活小牛血清的布氏肉汤中放于4°C冰箱中保存,送检。

实验标本来源于一位在首都医学院附属天坛医院接受胃镜检查的50岁的男性病人,病理学检查证实其胃粘膜是中度慢性浅表性胃炎伴中度活动性胃炎表现。胃镜检查时在胃窦部钳取胃粘膜组织2块,置于含10%小牛血清的布氏肉汤中,放于4°C保存4d后进行以下实验。

1.2 方法

1.2 胃粘膜组织尿素酶试验

1.2.1 尿素试验
参考Christtensen尿素肉汤培养和mlorris等快速诊断法,先用2%液体尿素常规法,后用10%液体尿素1min检查法及5%尿素滤纸片法,进行了对比研究。

参考Christensen尿素肉汤培养和Morris等快速诊断法,采用2%液体尿素常规法,于4h及24h观察结果。

1.2.2 直接涂片镜检
用保存液将胃粘膜研磨成匀浆后,取一滴推成涂片,甲醇固定后用0.3%碱性复红单染,于显微镜下直接检查。

1.3 细菌分离培养及纯化

1.2.3 幽门螺杆菌培养
以布氏琼脂培养基为基础,加入6%脱纤维新鲜羊血及联合抗生素,制成血平皿,放置4°C冰箱中保存、备用。从送检的Hp保存液中用白金耳取出胃粘膜组织块放入玻璃研磨器中,加入0.5ml保存液,研磨成匀浆,用1ml吸管吸取0.2ml于血平皿中涂匀,将平皿置于10%CO2,5%O2及85%N2混合气体培养箱中,37°C培养72h后观察培养结果。剩下
液体匀浆于尿素酶快诊及直接涂片镜检。

在灭菌研磨器中将胃粘膜组织研磨成匀浆,涂于含6%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中,将平板置于含10%CO22、5%O2及85%N2的混合气体培养箱中,37°C培养3d后涂片,在光镜下观察培养结果。在含10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中进行Gh菌单菌落纯分离,并测定其尿素酶、氧化酶及过氧化氢酶活性。

1.2.4 药敏试验
抗菌药物敏感试验所用试纸系参考WHO建议的药敏试验质量控制标准及国内外有关资料制备而成,由大连生物试剂厂生产,专供用纸片扩散法来检测细菌对抗菌药物的敏感度。试验中所用菌液为用0.1%胨生理盐水洗下的37°C48h培养物,浓度为2×109cfu/ml。用1ml吸管取0.1ml菌液于血平皿上,涂匀,之后将药敏片按适当的间距平贴于平皿上,一般9m直径的平皿上贴6张药敏片。最后将平皿置于混合气体培养箱中37°C培养48~72h,观察试验结果,测量抑菌环直径。

1.4 不同培养条件下Gh生长情况

1.2.5 杀螺杆菌抗体检测
原理:氧化酶反应阳性的细菌,由于氧化酶的作用,可使TTC用灭菌蒸馏水配成0.5%的溶液;指示菌用Hp295
37°C48h的培养物,其浓度为107cfu/ml;补体一指示菌悬液的制备:补体取4只豚鼠的新鲜分离血清,用生理盐水作1:20稀释,再加入最终浓度为1%的指示菌,即为浓度相当于105cfu/ml的补体—指示菌悬液;微量定量板用4×10孔板。方法:①每孔先加入0.1ml生理盐水。②第一孔加入1:5被检灭活血清0.1ml,之后顺序作从1:10~1:5120的对倍稀释。③每孔加补体—指示菌悬浮液一滴,约0.05ml。④最后每孔加入含0.01%TTC布氏肉汤0.1ml用布氏肉汤将新培养的Hp菌洗下,浓度大约配成2×109cfu/ml,每只小鼠一次灌胃约0.5~1ml菌液,每周2次,共4次~6次,末次灌胃后3~7d,处死动物,解剖后取两块胃粘膜组织作尿素酶快诊和Hp菌培养及组织切片。

①将纯化的Gh菌分别接种于含6%与10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中,置混合气体环境,37°C培养3d,涂片检查细菌形态。②将纯化的Gh菌接种于含6%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中,局部分别滴加灭菌的布氏肉汤、新鲜脱纤维绵羊血及冻融脱纤维绵羊血,并分别加盖一片灭菌的盖玻片,使覆盖部位呈厌氧状态。放37°C培养3d,观察细菌菌落生长情况及涂片观察细菌形态。③将纯化的Gh菌接种于含10%小牛血清的布氏肉汤小管中,放混合气体环境,37°C培养3d后,直接涂片及离心沉渣涂片观察细菌形态。④将置于保存液中,-70°C保存30d后的Gh菌,接种于含10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中,37°C培养3d后,观察菌落生长情况、涂片观察细菌形态、测定其尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶活性,并继续传代观察其形态变化。

1.2.7 统计学方法 统计学方法采用X2检验。

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2 结果

胃粘膜组织尿素酶试验4h及24h均为阴性。细菌初代培养物涂片发现含有Gh和Hp两种菌。经单菌落分离分别得到Gh和Hp菌的纯培养,其中分离到的Gh菌株命名为Gh32。对Gh32的测定发现其氧化酶与过氧化氢酶均为阳性。并含有很强的尿素酶活性。Gh32在含有6%脱纤维绵羊血的布氏培养基上生长较差,菌落呈针尖状。光镜下可见细菌呈球形、肾形及短螺旋形,多数菌仅一个弯曲。在含10%脱纤维绵羊血的布氏培养基上生长良好,可长成1mm~2mm直径单个菌落,光镜下可见细菌呈多螺旋状,螺旋数目在1~6个之间,且螺旋较密。Gh32在盖玻片下生长不良;在滴加布氏汤和未滴加任何液体的对照部位,细菌菌落较小,呈针尖状。在滴加新鲜血或冻融血而未被盖玻片覆盖处,菌落形态及光镜下细菌形态与在含10%脱纤维绵羊血布氏琼脂平板上生长的情况相似。Gh32在液体培养时生长较慢,3d后液体仅轻度混浊,涂片发现细菌数目较少,但菌形良好,螺旋数在3~14个不等,长度可达17μm左右。经3,000r/min离心3min后沉渣用少许生理盐水悬浮涂片发现,多数细菌螺旋数在4~6个左右。将低温保存Gh32初代复活时,菌落生长良好。酶活性检查发现,其尿素酶、氧化酶及过氧化氢酶均为阳性。涂片发现几乎所有菌体均发生了球形变。连续传代2次后,70%左右恢复典型形态,连续传代3次后细菌几乎全部恢复其典型形态。

2.1 尿素酶快速诊断
Hp能产生大量的尿素酶,分解尿素产生氨,使pH值升高,据此将尿素酶液全培养基颜色由桔黄色变为粉红色的反应定为阳性反应。试验结果如表1所示:

3 讨论

表 1 不同时间尿素酶快诊结果

人们对胃螺旋菌的认识已有一个较长的历史过程。早在1881年Rappin就报道在狗胃粘膜中观察到螺旋形细菌的存在,此后又有许多在其它哺乳动物胃粘膜中观察到螺旋形细菌存在的报道。1906年Krienitz首先观察到人胃粘膜中有3种不同类型的弯曲或螺旋细菌存在,但此后胃螺旋菌未能引起人们的足够重视。随着对幽门螺杆菌与胃炎及消化性溃疡的关系的深入研究,人们开始重新对人胃螺旋菌进行认识。目前认为此菌可能为除Hp外的又一类与胃炎有关的细菌。自1987年来世界各地已有近百例有关Gh感染的报道,国内杨海涛等也曾报道14例Gh感染病人。人们自猪等动物已成功地分离到了胃螺旋菌,近年来国内外多位学者曾对Gh进行分离培养,但至今未见有关Gh培养成功的报道,对Gh的研究也仅限于对病理组织学的观察。我们自人胃粘膜组织中成功地分离到一株Gh,为对Gh的深入研究创造了必要条件。

时间受检标本数合计阳性率阳性阴性4165135300552418611430062

虽然目前我们只分离到一株Gh菌,可能不能完全反映所有Gh菌所需要的培养条件,但我们在实验中观察到了Gh菌形态的易变性。在不同培养条件下,Gh可呈1~14个螺旋不等,甚至呈肾形或球形。Gh在培养条件不完全适合时,不能表现出其典型形态,而胃粘膜标本中往往有多种细菌存在,在选择性培养基上也可能不止有一种细菌生长,对形态不典型的Gh菌,很容易被当成杂菌或Hp菌处理。我们在分离猪胃螺旋菌(Gastrospirillumsuis)时也曾发生类似情况,一度将一株猪胃螺旋菌作为幽门螺杆菌样细菌处理过,后来在半固体及液体培养时才观察到其典型形态。Gh在人群中的感染率相对较低,更增加了Gh分离培养成功的难度。我们认为以上因素可能是造成以往分离培养Gh失败的主要原因。这提示人们,在作Gh分离培养时,如观察到可疑Gh菌存在时,应增加培养基中含血量或进行液体培养,以便使Gh表现出其典型形态。由于Gh在固体培养基中菌形较短,而在液体培养时,虽菌形良好,但菌量较少,有关Gh的最适培养条件问题,仍需进一步探讨。

从表中看出,4h和24h尿素酶快诊的阳性率分别为55%和62%。在300份胃病患者的胃粘膜Hp培养中,有195例为阳性。阳性率为65%,与4h尿素酶快诊阳性率之间无显著性差异,。尿素酶快诊阳性结果与Hp培养阳性结果之间的对应关系良好,培养出的195例Hp菌株作尿素酶快诊,在1min内均呈阳性反应,特异性达100%。而4h和24h尿素酶快诊的敏感性分别为84.6%(165/195)。因此用尿素酶作Hp快诊,在早期及Hp培养后进行,均有其非常特异而重要的意义。

实验表明,Gh为微需氧菌,氧化酶和过氧化酶均为阳性,且有很高活性的尿素酶,而在胃粘膜组织直接尿素酶活性检测时则为阴性,这可能与胃粘膜中Gh菌量较少有关。提示胃粘膜组织尿素酶阴性的依据,也不能反映Gh产生尿素酶活性的强弱。

2.2 直接涂片镜检
对其中21例作了直接涂片镜检,结果有4例镜下可见成簇Hp占19.0%;有1例镜下易找到Hp,占4.8%;有9例镜下可见Hp零星存在,占42.9%;6例镜检为阴性。镜检阳性率为66.7%。21例Hp
培养阳性为16份,阳性率为76.2%,与镜检阳性率之间无显著差异。镜检阳性符合率为87.5%(14/16)。

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